目前中国抗体药物市场空间巨大，同时国家支持政策力度很大，单抗产业化正进入关键的发展时期。抗体药物成药性评价、高效稳定性细胞株构建、上下游工艺开发、分析方法开发与验证、制剂工艺开发等各个环节都很关键，而其中的最关键的阶段是细胞株与上游工艺的环节，它决定了整体开发时间与质量。
近日，由佰傲谷主办的“细胞株构建与上游工艺技术沙龙”活动在浦东国际人才港圆满举行。
Speaker1 李浩强--杭州皓阳生物总经理
高表达稳定细胞株构建策略
-浅析不同宿主细胞差异
李总首先介绍了细胞株构建的概况。构建一个好的细胞株所设定的目标正如奥运精神一样：更快（faster），更高（Higher），更强（Stronger）。更快，要求细胞筛选时间短；更高，要求细胞产量更高；更强，要求细胞株在生物反应器上的工艺更稳健。细胞株的构建与载体、宿主细胞、Pool/clone的筛选、细胞培养的工艺密不可分。不同的宿主细胞在细胞倍增时间上会有差异，同时在蛋白表达量和质量上也会有差异。
其次，李总介绍了皓阳生物。皓阳生物有CHO-DG44，CHO-K1，CHO-K1/GS，三种不同的抗体表达平台，其中后两者使用的宿主细胞来源一致，但是GS系统使用MSX进行筛选。
最后李总结合实例介绍了细胞株构建的两个案例。因CHO-DG44和CHO-K1宿主细胞生长情况不一样，DG44翻倍时间一般比CHO-K1长，故在细胞株构建时采用不同的构建流程，主要差异在于CHO-DG44采取bulk pool筛选，而CHO-K1和K1/GS采用minipool筛选。
实际案例1
案例1：mAb，采用Dynamis为基础培养基，以CB7a,7b为补料培养基，在摇管体系下评估了DG44, CHO-K1 and CHO-K1/GS三种不同宿主细胞pool的差异，第14天或者活率低于80%时收获，上清经一步亲和层析纯化后检测分析，结果显示，CHO-K1/GS表达系统表达的蛋白产量和Qp都明显优于其余两种。
从DG44, CHO-K1和CHO-K1/GS三个表达系统构建的Pool中选择三个产量和Qp比较高的三个细胞pool进行质量的测定，结果见下表。发现不同细胞株平台构建的细胞pool所表达的单抗在Man-5比例上差异明显，DG44细胞系Man-5比例最低，在实际工作中可以选择构建多种细胞系的Pool比较产品的质量，最后确定一个细胞系筛选单克隆。最后李总表示正针对Man-5进行优化实验，预计通过培养基/补料以及工艺参数优化可以有效进行针对性调节，在后续的分享活动中会进一步与大家交流沟通。
表1 DG44, CHO-K1 and CHO-K1/GS三种不同细胞系pool表达抗体产量和糖型差异
实际案例2
案例2介绍了采用DG44和CHO-K1两种宿主细胞构建细胞株表达FC融合蛋白的案例。CHO-K1表达的产量要高于DG44，同时在蛋白的SEC和iCIEF两个质量属性方面也优于DG44。
表2 DG44与CHO-K1不同Pool表达的蛋白 SEC和iCIEF的差异
最后，选择CHO-K1 pool 1做单克隆筛选得到top 4克隆，并对其中三个克隆在1L反应器上进行了工艺开发与验证确认，最后在200L上做了三批生产，重复性很好，蛋白表达量保持在5.0-5.5g/L 之间。
Speaker2 袁军--中山康晟生物副总裁
康晟-生物制药合作探索
袁博士首先介绍三方面平台：细胞株构建平台（提供CRO服务及授权的CHOK-Q宿主细胞），培养基开发平台，培养基制造平台（如下图）
广东中山康晟生物 平台介绍
其次袁博士详细介绍细胞株构建平台，从宿主细胞、分子生物学、表达载体、信号肽、目的基因密码子优化、转染条件、筛选策略、单克隆筛选、培养工艺等方面讨论了细胞株表达量和质量的影响。袁博士从CHO宿主细胞历史溯源开始展开，不同宿主细胞来源进行讲解，同时将不同宿主细胞授权费用、表达量、载体、培养基工艺进行总结（如下表）
表3 CHO宿主细胞信息表
袁博士讲到：双载体、单载体都有使用，载体优化后，需要后期大量工作验证，且耗时比较长，从经济角度考虑建议使用商品化的载体。信号肽的优化也很重要，可以参考文献报道的信号肽，但需结合自身项目进行优化。细胞株的筛选需要综合平衡各项指标：比如细胞生长情况，表达量，稳定性，产物质量等。
最后袁博士讲解了培养基平台。将培养基开发比喻成“老中医把脉”，首先要有配方库，还要有高通量筛选平台，这样就可以进行混合实验，影响因子试验，通过系统性、科学性的统计分析得到合适的培养基组合。
培养基设计过程中要考虑：提高产量，保持细胞密度，活率，配方要尽量简单，配方的稳定性，乳酸和氨离子浓度，蛋白质量等因素，平衡这些因素，得出最优解。
实际案例：
根据A,B,C三个细胞的不同特点进行优化。方法为：用配方库筛选，80种培养基，筛选出5种基础培养基，然后进行16种feed的筛选，共80种组合，高通量筛选方式。最后通过DOE实验确定基础培养基和补料培养基。
经过培养基优化后，A细胞的密度和产量均有升高；B 细胞在保证产量不变的情况下，生产周期缩短了4天；C细胞产量提高了1倍。表4为优化前后对比结果。
表4 培养基优化应用结果
Speaker3 特邀嘉宾
双抗药物稳定细胞株开发过程中的
几点思考
1.双抗药物开发现状
2.对Format的深入理解在细胞株开发中的重要性
3.质量监测方法在双抗细胞株开发中的重要性
4.两个设计+两个策略
5.公司介绍
Speaker4 储成亮副总经理
生产工艺转移过程中风险管理的运用
1）为什么要重视风险管理？
1.药品研发过程中中一个项目从概念提出到实践得出结果，其过程充满了风险（也即现实与理想之间的差距，）。研发过程中的风险累积是造成现实与理想之间差距的重要因素（所谓”失之毫厘，谬以千里“），所以在研发过程中要重视风险管理，控制现实与理想之间的偏差。
2.风险管理已经是在指导文件中体现---《质量风险管理》（ICH Q9）&《药品医疗器械飞行检查办法》（国家食品药品监督管理总局令第14号），要求药企在整个药品生命周期中对质量风险进行管理以及做好应对围绕药品安全风险防控的飞行检查。
2）风险管理带来的益处
1.对公司管理层---进行风险管理必定会有确定的适用目标，而目标一旦确定就会排除无关因素干扰，着力目标的风险管控。
2.对项目管理—在项目执行过程中容易寻找到影响风险的关键指标（比如在工艺过程中的CPP（关键工艺参数）、CQA（关键质量属性））
3.对于监管者---拥有良好的风险管理体系可以增强监管者对于企业产品质量的信心（减少监管沟通成本）
4．项目执行人—方便对产品质量进行有效的沟通
3）风险管理的认识
1、风险管理的流程
2.值得注意的事项
2.1风险管理是提高工作效率的手段之一---规避人为因素的风险，提高团队协作
2.2风险管理不是万能的---尊重事实，风险管理只是一种方法无法改变事实
2.3风险管理需要因地制宜---根据公司的实际情况采用
4）风险管理的应用—以”工艺转移阶段生产用培养基存储“为例
第一步：风险因素识别
第二步：风险因素分析
第三步：风险因素评估---采用PHA法对所有因素的影响进行评估
此外，对于能够通过实验确定的一些关键因素，可以通过现场试验以确定最佳参数。（例如：温度、光照的风险评估）
第四步：根据风险评估的结果制定风险控制措施
结论：
01.完成了设备的选型，确定了关键设备的风险控制方案，制定了合理的文件管理体系
02.通过风险分析与风险评估，确定了影响培养基存储的关键质量属性，找到了存储培养基的最优方案
03.优化了配套工程，节约了大量的建设资源
5）总结—风险管理好方法，谁用谁知道！
效率高 ：目的性强，极大提高项目的运行效率
解决问题方法：将复杂问题简单化，更容易找到影响结果的核心因素
管理与沟通：独木不成林，需要不同专业人员的参与
圆桌讨论--所有受邀嘉宾
从最开始进入沙龙开始，所有嘉宾带着问题聆听四位资深老师演讲报告，其中两次圆桌讨论，以及现场嘉宾互动，将细胞株构建和上游工艺等技术细节进行彻底讨论，真正将干货分享给参与听众。
据了解，参与本次活动的嘉宾有从重庆赶来的，有从山东烟台赶来的，也有从南京、宁波、苏州、杭州等地赶过来的，大约有180位嘉宾参加此次沙龙活动，此次技术沙龙活动广受欢迎。