现场|浦东国际人才城产业俱乐部Science Café沙龙第17期
随着研究人员对新药研发的不断探索，近年来涌现出了像动态蛋白（Protein Motion）、蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）、基因转录模拟（Transcriptional mimetic）、小分子辅助受体靶向（SMART）等一批新兴药物研发技术。其中PROTACs技术近日备受关注。今年3月初，位于美国特拉华州的初创公司Cullgen获得1500 万美元种子轮融资，该公司专注于利用泛素介导的蛋白降解技术平台uSMITETM开发新药，其核心技术源自于北卡罗来纳大学熊跃教授团队和西奈山伊坎医学院金坚教授团队的研究成果。
Science Café 17
4月27日，浦东国际人才发展中心、复旦大学上海市药物研发协同创新中心联合举办第17期Science Café活动，特邀Cullgen公司的资深科学家刘京博士，为咖友们分享PROTACs技术面临的机遇和挑战，以及他所在的团队开发ALK的蛋白降解靶向嵌合体的研发经验。
以下为刘博士精彩报告的总结，中心诚邀咖友们一同来品味这份“意式特浓”。
▲ 刘京博士与大家分享ALK蛋白降解靶向嵌合体研发历程
壹
PROTAC技术可克服传统小分子药物的局限性
传统小分子药物的研究具有许多局限性——首先，体内并非所有蛋白都能作为药物靶标，如骨架蛋白、转录因子及其他非酶蛋白等大部分都被视为“不可成药靶标”，即使是具“可成药性”的靶蛋白，还必须保证其有合适的结合口袋才能使药物发挥作用；其次，靶蛋白一般需要较高剂量的药物持续占据结合位点才能激活其活性，但高剂量药物往往会导致药物脱靶产生一系列副作用；此外，靶蛋白靶位结构的改变或机体应激性过量表达靶蛋白均可能导致耐药性的产生。
蛋白降解靶向嵌合体（Proteolytic targeting chimeras，PROTACs）通过细胞内泛素-蛋白酶体降解系统调控靶蛋白水平，其通过新思路克服了传统小分子药物研发存在的缺陷，具有广泛的靶标、低药物暴露量的特性，并有望解决传统小分子药物耐药性问题。
PROTACs分子有三个基本组成部分：一头是与靶蛋白（protein of interest，POI）结合的结构（POI binder），另一头是可以招募蛋白降解体系（如E3泛素连接酶）的结构（E3 ligand），中间通过合适的linker连接。
图片来源：J. Med. Chem. 2018, 61, 583−598
linker将靶蛋白与E3泛素连接酶连接，靶蛋白泛素化后，即可招募泛素化降解蛋白使其降解。PROTACs仅仅通过linker连接到靶蛋白上，即可将没有明显活性的“不可成药”的靶蛋白纳入到目标蛋白范畴中，克服了传统小分子药物靶标局限性；同时，靶蛋白结合口袋的短暂性占位和PROTACs的重复利用降低了药物的暴露量，尽可能避免了高剂量药物导致的毒副作用的产生。基于这一特点，该技术的应用范围显著增加，这也使我们能利用现有的E3泛素化连接酶去降解新发现的靶蛋白。目前常见的E3泛素连接酶的配体有Nulin-3a（MDM2）、LCL161（cIAP）、Pomalidomide（CRBN）、VHL-1（VHL）。
Science Café 17
贰
ALK是PROTACs的理想靶点，有望开发抑制非霍奇金淋巴瘤细胞生长的新药
目前PROTACs应用的靶点包括Bromodomain系列、激酶（Kinases）系列、组蛋白去乙酰化酶及及一些其他靶点。研究表明，ALK的活性与许多肿瘤有着密切关系，且在正常成年动物体内ALK蛋白的表达非常低，并非是哺乳动物的生存必需蛋白，具有较高的选择性，预期ALK的降解在临床中仅产生较低的毒副作用。因此，ALK是PROTACs较理想的靶点。
刘博士所在的团队开展了基于ALK靶点的PROTACs技术研究，团队首先以FDA已经批准的四个ALK抑制剂作为PROTACs的POI binder，其中Ceritinib药物因其具有高效、高度选择性的特点，成为团队设计新型POI binder的结构基础。团队设计了具有长短两种linker的新型PROTACs，实验证明其中两个新型PROTACs与ALK有较高的相关性。体外实验证明新型PROTACs与ALK有浓度依赖性和时间依赖性，ALK的降解抑制了两种肿瘤细胞的ALK下游信号通路，起到了抑制肿瘤细胞生长作用，后续在小鼠动物实验中，该新型PROTACs有较好的生物利用度。关于ALK PROTACs的研究，详见刘博士所在团队最近发表的论文（Eur. J. Med. Chem., 2018, 151, 304-314）。
Science Café 17
叁
PROTACs仍面临靶蛋白和Binder选择、linker优化以及药代动力学等问题的挑战
PROTACs虽然有诸多优势，但现阶段仍面临诸多问题。
首先是PROTACs靶蛋白的选择仍存在局限性。理论上，PROTAC技术可以用于降解任何所需靶蛋白，但靶蛋白水平的下调不应影响细胞或动物的正常生理代谢，所以靶蛋白的选择仍需探索； E3泛素连接酶配体的种类仍然受限，现阶段严重依赖于CRBN，VHL和cIAP三种配体，仍需寻找有效且高选择性的靶蛋白Binder和Linker。
其次是PROTACs靶标选择性问题。设计PROTACs时，虽然预期其降解目标是靶蛋白，但仍存在脱靶现象，因此，需要合理评估设计具有高选择性的PROTACs；另外，E3连接酶配体的选择也可引起脱靶现象。
其他问题还包括：高PROTACs浓度可能导致的钩状效应（Hook effect）；如何设计PROTACs使其具有合适的DMPK值、较高的口服生物利用度；对体外细胞或体内动物模型要求高，需要该模型能在病变细胞和组织中同时表达POI和功能性E3泛素连接酶；由于POI和E3泛素连接酶的突变和补偿激活途径导致的耐药性问题等等。
尽管前方仍挑战重重，但随着越来越多的药企、实验室进军PROTACs技术领域，我们有信心期待这一全新的研发思路早日为我们带来创新药物！
Science Café 17
4月27日，浦东国际人才发展中心、复旦大学上海市药物研发协同创新中心联合举办第17期Science Café活动，特邀Cullgen公司的资深科学家刘京博士，为咖友们分享PROTACs技术面临的机遇和挑战，以及他所在的团队开发ALK的蛋白降解靶向嵌合体的研发经验。
以下为刘博士精彩报告的总结，中心诚邀咖友们一同来品味这份“意式特浓”。
▲ 刘京博士与大家分享ALK蛋白降解靶向嵌合体研发历程
壹
PROTAC技术可克服传统小分子药物的局限性
传统小分子药物的研究具有许多局限性——首先，体内并非所有蛋白都能作为药物靶标，如骨架蛋白、转录因子及其他非酶蛋白等大部分都被视为“不可成药靶标”，即使是具“可成药性”的靶蛋白，还必须保证其有合适的结合口袋才能使药物发挥作用；其次，靶蛋白一般需要较高剂量的药物持续占据结合位点才能激活其活性，但高剂量药物往往会导致药物脱靶产生一系列副作用；此外，靶蛋白靶位结构的改变或机体应激性过量表达靶蛋白均可能导致耐药性的产生。
蛋白降解靶向嵌合体（Proteolytic targeting chimeras，PROTACs）通过细胞内泛素-蛋白酶体降解系统调控靶蛋白水平，其通过新思路克服了传统小分子药物研发存在的缺陷，具有广泛的靶标、低药物暴露量的特性，并有望解决传统小分子药物耐药性问题。
PROTACs分子有三个基本组成部分：一头是与靶蛋白（protein of interest，POI）结合的结构（POI binder），另一头是可以招募蛋白降解体系（如E3泛素连接酶）的结构（E3 ligand），中间通过合适的linker连接。
图片来源：J. Med. Chem. 2018, 61, 583−598
linker将靶蛋白与E3泛素连接酶连接，靶蛋白泛素化后，即可招募泛素化降解蛋白使其降解。PROTACs仅仅通过linker连接到靶蛋白上，即可将没有明显活性的“不可成药”的靶蛋白纳入到目标蛋白范畴中，克服了传统小分子药物靶标局限性；同时，靶蛋白结合口袋的短暂性占位和PROTACs的重复利用降低了药物的暴露量，尽可能避免了高剂量药物导致的毒副作用的产生。基于这一特点，该技术的应用范围显著增加，这也使我们能利用现有的E3泛素化连接酶去降解新发现的靶蛋白。目前常见的E3泛素连接酶的配体有Nulin-3a（MDM2）、LCL161（cIAP）、Pomalidomide（CRBN）、VHL-1（VHL）。
Science Café 17
贰
ALK是PROTACs的理想靶点，有望开发抑制非霍奇金淋巴瘤细胞生长的新药
目前PROTACs应用的靶点包括Bromodomain系列、激酶（Kinases）系列、组蛋白去乙酰化酶及及一些其他靶点。研究表明，ALK的活性与许多肿瘤有着密切关系，且在正常成年动物体内ALK蛋白的表达非常低，并非是哺乳动物的生存必需蛋白，具有较高的选择性，预期ALK的降解在临床中仅产生较低的毒副作用。因此，ALK是PROTACs较理想的靶点。
刘博士所在的团队开展了基于ALK靶点的PROTACs技术研究，团队首先以FDA已经批准的四个ALK抑制剂作为PROTACs的POI binder，其中Ceritinib药物因其具有高效、高度选择性的特点，成为团队设计新型POI binder的结构基础。团队设计了具有长短两种linker的新型PROTACs，实验证明其中两个新型PROTACs与ALK有较高的相关性。体外实验证明新型PROTACs与ALK有浓度依赖性和时间依赖性，ALK的降解抑制了两种肿瘤细胞的ALK下游信号通路，起到了抑制肿瘤细胞生长作用，后续在小鼠动物实验中，该新型PROTACs有较好的生物利用度。关于ALK PROTACs的研究，详见刘博士所在团队最近发表的论文（Eur. J. Med. Chem., 2018, 151, 304-314）。
Science Café 17
叁
PROTACs仍面临靶蛋白和Binder选择、linker优化以及药代动力学等问题的挑战
PROTACs虽然有诸多优势，但现阶段仍面临诸多问题。
首先是PROTACs靶蛋白的选择仍存在局限性。理论上，PROTAC技术可以用于降解任何所需靶蛋白，但靶蛋白水平的下调不应影响细胞或动物的正常生理代谢，所以靶蛋白的选择仍需探索； E3泛素连接酶配体的种类仍然受限，现阶段严重依赖于CRBN，VHL和cIAP三种配体，仍需寻找有效且高选择性的靶蛋白Binder和Linker。
其次是PROTACs靶标选择性问题。设计PROTACs时，虽然预期其降解目标是靶蛋白，但仍存在脱靶现象，因此，需要合理评估设计具有高选择性的PROTACs；另外，E3连接酶配体的选择也可引起脱靶现象。
其他问题还包括：高PROTACs浓度可能导致的钩状效应（Hook effect）；如何设计PROTACs使其具有合适的DMPK值、较高的口服生物利用度；对体外细胞或体内动物模型要求高，需要该模型能在病变细胞和组织中同时表达POI和功能性E3泛素连接酶；由于POI和E3泛素连接酶的突变和补偿激活途径导致的耐药性问题等等。
尽管前方仍挑战重重，但随着越来越多的药企、实验室进军PROTACs技术领域，我们有信心期待这一全新的研发思路早日为我们带来创新药物！